前言
中风是成人致残的主要原因，其中大部分是由脑梗塞引起的。区分缺血性卒中患者(IS)和模拟卒中患者(SMS)是很重要的，因为错误的分类可能会导致不适当的干预，阻止有效的治疗，以及资源的低效分配，如卒中单元护理。多模式计算机断层扫描(CT)的常规诊断在区分IS和SMS方面的能力有限。因此，对新型诊断标记物的需求很大。循环代谢组灵敏地捕捉多个器官的病理生理事件，因此可能反映与急性IS相关的事件，如脑损伤、全身反应(如应激)和血管内的过程。
本篇，作者使用非靶向代谢组学的发现-验证方法来识别能够区分IS和SM的代谢物。作者进一步进行了系统的文献回顾，以确定在症状出现后的24小时内与IS相关的循环代谢物，并评估相关代谢物的诊断价值。
本篇由来自于德国慕尼黑大学中风和痴呆症研究所斯蒂芬·蒂德博士在ANNALSOFNEUROLOGY期刊（IF:11.）发表了题为的研究成果，通过代谢组学研究方法，发现了不对称和对称的二甲基精氨酸、孕烯醇酮硫酸盐和腺苷特征这四种代谢产物可以更好地鉴别急性缺血性卒中与拟卒中，优于常规诊断的多模式颅脑CT(CT；AUC=0.80)和样本中检测到的先前发表的代谢物集合。这一组与中风病理生理学相关的已知生物学效应的4种代谢物，医院时识别IS患者，从而鼓励进一步深入的研究，为性缺血性卒中与拟卒中鉴别提供相关的诊断价值。
研究方法
1.实验分组/研究材料
（1）1期实验（发现阶段）：正常对照组NC；卒中患者组IS
（2）2期实验（验证阶段）：正常对照组NC；卒中患者组IS
（3）3期实验（推导阶段）：模拟卒中组SM；卒中患者组IS（2期样本）
（4）4期实验（验证阶段）：模拟卒中组SM；卒中患者组IS
（5）5期实验（重复阶段）：模拟卒中组SM；卒中患者组IS
2.技术路线
2.1生理/病理分析：医院常规项目检查、家族病史调查、CT检查、NIHSS美国国立卫生研究院卒中量表评分、磁共振成像(MRI)检查
2.2代谢组学：LC-MS非靶标代谢组分析
2.3统计分析：常规数据统计、两阶段递增法、5次重复的10倍交叉验证、多元线性回归模型、支持向量机、线性判别分析、棵树次运行的随机森林、K近临分析、朴素贝叶斯、逻辑回归
研究结果
1.第1期（发现阶段）筛选出49种代谢物，其中通过第2期（验证阶段）筛出有41种
在发现阶段样本(1期)的个测定代谢物中，不到50%的样本检测到个代谢物，剩下个代谢物进行分析。将IS患者与NC患者进行比较，发现样本中有49种代谢物符合预先指定的统计意义标准(1期；见图1A、表1B)。在验证阶段样本(2期)中，其中41种也符合这些标准，包括16种脂肪酸，类固醇皮质醇和孕烯醇酮硫酸盐，三羧酸(TCA)循环中间体柠檬酸和苹果酸(均升高)，脯氨酸，以及核苷腺苷、鸟苷和肌苷。
图1A
采用发现-确认方法的抽样和分析策略对NC、IS和SM样本进行比较
表1B
49种代谢物的统计数据，按p值排序
2.六种分类模型中随机森林的分类效果最好
可以看到六种分类模型（图1D，SVM：支持向量机、LDA：线性判别分析、RF()*：棵树次运行的随机森林、KNN：K近临分析、NB：朴素贝叶斯、LR：逻辑回归）中，随机森林的分类效果最好，故选择随机森林模型。在随机森林分类中，30种内源性代谢物将IS患者与NC区分开来，曲线下面积(AUC)为0.(图1C)。
图1C
随机森林模型的AOC曲线
图1D
6种分类模型的AUC对比
3.进一步分析挑选出4种代谢物
随机森林分类结果的分层聚类显示了相当大的共线性，特别是在脂肪酸之间(图2E)，表明分类器中存在冗余。在考虑共线性的情况下为简化分类器鉴别IS和SM的信息最丰富的代谢产物（图2A），作者评估了随机森林条件变量的重要性，发现不对称二甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸、孕烯醇酮硫酸盐和腺苷排名最高(3期)。
图1E
随机森林分类结果的分层聚类热图
图2A
随机森林变量重要性分析排名前10结果
4.进一步分析挑选出4种代谢物
与多模态CT相比，这4种代谢物的敏感性为82.5%，特异性为84.9%，其AUC更高(0.90vs0.74,3期;图2B)。在验证样本中也得到了类似的结果(4期，敏感性:92.4%，特异性:82.9%;图2C)。通过倾向评分匹配选择，进一步控制潜在的混杂因素，如人口统计学、血管危险因素和药物治疗(N=;图2A)，在继续招募的复制样本中表现依旧更好(第5期，敏感性:88.6%，特异性:72.7%，AUC=0.90,N=;图2D)。作者进一步进行了2项敏感性分析：第一，排除接受重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的SM患者;第二，排除接受rt-PA治疗后采血的IS患者。两种分析结果相似(图2E)。选定的4种代谢物组也能区分IS和NC患者(AUC=0.92;图2F)。
图2B
四种代谢物在3期样本中的预测效果
图2C
四种代谢物在4期样本中的预测效果
图2D
四种代谢物在5期样本中的预测效果
图2E
四种代谢物在4期样本中的预测效果（排除rt-PA样本）
图2F
四种代谢物在5期样本中的预测效果（排除rt-PA样本）
5.进一步评估预示代谢物水平变化与急性事件之间的联系
4种诊断代谢物的水平在中风后第90天(D90)基本恢复正常(图3A)，从而证明了第1天(D1)代谢物水平变化与急性事件之间的联系。入院时，心栓塞性卒中患者的SDMA水平(D1)明显高于大动脉粥样硬化性卒中和病因不明的卒中患者(图3B，5期)。孕烯醇酮硫酸盐水平与梗死体积(β=0.66,p0.;图3C，5期)以及入院时国立卫生研究院卒中量表评分(β=0.47,p=0.)显著相关。在评估分析前变异性的影响时，作者发现腺苷水平与分析前样品处理时间呈负相关(图3D，4期)，重要的是，在IS患者和SM患者之间没有差异(51vs51分钟，p=0.81)。有94.2%的样品是在40-70分钟内加工的。
图3A
四种代谢物水平在卒中后第90天恢复到对照水平
图3B
不同患者四种代谢物水平在入院时的水平对比
图3C
四种代谢物水平与脑梗塞体积关系
图3D
四种代谢物水平与检测时间关系
6.检索数据库筛选出5项过去研究用于对比
为了将作者的发现与之前报道的与急性IS相关的代谢物集联系起来，作者进行了一项系统回顾，搜索提供IS患者循环代谢物数据的研究，这些研究仅限于症状出现后24小时内的血液采样。在鉴定的项记录中，有5项研究符合选择标准(表2)。所有研究均为单中心、医院的研究，比较IS患者与NC患者(4项研究)或头痛或眩晕患者(1项研究)。大多数(4项研究)缺乏独立样本的验证。总的来说，这些研究报告了41种与IS相关的不同代谢物，研究之间只有1种代谢物重叠。
表2
5项过去研究的在当前项目中的结果
7.本次筛选的30种代谢物中有4种与过去的研究表现出了相同的方向性
41种代谢物中有24种在作者的数据集中。对当前数据集的针对性查找发现，在发现样本(第1期)的基本模型中有11种代谢物满足预先指定的统计显著性标准，在完整模型中也有4种代谢物(腺苷、脯氨酸、丙基肉碱和12-羟基乙二烯酸[HETE])满足标准，所有代谢物都具有相同的方向性。这4种代谢物在验证样品中也符合标准。在当前研究(1期和2期)中识别和验证的30种异常内源性代谢物中，有5种(12-羟基乙二烯酸、腺苷、脯氨酸、油基肉碱和丙基肉碱)在以前的研究中进行了评估。值得注意的是，其中4个(80%)是异常的，并且在之前的数据集中表现出相同的方向性。
8、本项目筛选的代谢物比前人研究有更好的分类表现
在作者的发现和验证样本(第1期和第2期)中，用发表的代谢物集获得的用于区分IS和NC患者的AUC值从0.61到0.80(见表2)，这与当前样本中识别的代谢物集(发现和验证样本中分别为0.93和0.96)相比显著降低。应用已发表的代谢物集来区分IS患者和作者数据集中的SM患者，显示AUC值低于0.7(3-5期)。
研究结论
在区分IS患者和SM患者的诊断准确性方面的改进已逐步被证明在患者安全、临床结果、成本效益方面皆有益处。多模式CT是目前入院时检测颅内出血、血管闭塞的诊断标准，是全身溶栓和血管内治疗的组织窗口，但在症状出现后的6小时内，对于区分IS和SM的效用有限，其AUC值约为0.8，当前研究也反映了AUC值约为0.8。
ADMA、SDMA、硫酸孕烯醇酮和腺苷的鉴别能力在本研究中明显更高，据作者所知，这在血液生物标志物中是前所未有的。因此，代谢物组可以在无法使用MRI的紧急情况下补充CT成像结果。虽然非靶向代谢组学仍然需要大量的时间和成本，但随着技术的升级改进靶向代谢组学可以在较短的时间内定量分析，并在护理时定量分析，使临床应用成为可能。
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中风又称“脑卒中”（cerebralstroke）是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。本文在区分缺血性卒中患者(IS)和模拟卒中患者(SMS)鉴别运用代谢组学针对标志做了发现、验证及重复，确认ADMA、SDMA、硫酸孕烯醇酮和腺苷的鉴别能力在本研究中明显更高。
医院中风和痴呆症研究所初级研究组组长、副教授斯蒂芬·蒂特博士发表的一篇文章，本次研究筛选出了鉴别能力更高的四种代谢物，优于传统诊断，具有很高的临床应用意义，文中的筛选方式和发现验证的方法非常值得借鉴。
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